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    ELISA操作前必讀——【液體樣本處理】

    更新時(shí)間:2024-02-26 瀏覽次數:652

    可用于ELISA實(shí)驗的樣本一般有血清、血漿、尿液、細胞培養上清液以及組織勻漿等。不同樣本類(lèi)型的預處理方法也不同。(由于ELISA只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量,因此要求樣本應清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì))

    液體樣本處理原則:所有的液體樣本,用無(wú)菌管收集,2-8℃條件離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)

    【血清樣本】:將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃過(guò)夜,然后 1000×g 離心 20 分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    注意事項:收集血液樣本應避免溶血,因為紅細胞在溶解時(shí)會(huì )釋放具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì),這種情況下,ELISA實(shí)驗中將會(huì )出現非特異性顯色反應,導致檢測結果不準確,出現假陽(yáng)性結果。另外,樣本還應避免細菌污染,因為細菌可能含有內源性HRP,也會(huì )導致檢測結果不準確。

    【血漿樣本】:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    注意事項:檢測前請仔細閱讀ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū),查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。

    【組織勻漿】:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會(huì )影響測量結果),稱(chēng)重后將組織jian碎。將jian碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

    【細胞培養物上清】:請1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    【尿液、胸腹水、腦脊液】:用無(wú)菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清,保存過(guò)程中如有沉淀形成,應再次離心。

    【樣品保存】:為確保實(shí)驗的準確性,樣品收集后若在1周內進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測,請按一次使用量分裝,凍存于-20℃(1個(gè)月內檢測),或-80℃(6個(gè)月內檢測),避免反復凍融,標本溶血會(huì )影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進(jìn)行此項檢測。

    【注意事項】:樣本中不能含有會(huì )抑制HRP活性的NaN3,否則會(huì )造成假陰性結果。

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